本試劑盒僅供科研使用。用于體外定量檢測豬血清、血漿或細胞培養(yǎng)上清液中的IFN-γ濃度。使用前請仔細閱讀說明書并檢查試劑組分是否完整。如有產(chǎn)品包裝破損或質(zhì)量投訴，請在收到貨一個月之內(nèi)聯(lián)系我們。

豬IFN-γ簡介：

被稱為II型干擾素的IFN-γ，是由143個殘基構(gòu)成的，有20和25kDa亞型的糖蛋白，以頭尾相連的同型糖蛋白的形式存在。成熟的豬IFN-γ存在非共價結(jié)合的同型二聚體，由于糖鏈不同，分子量分別在20~25 kDa。成熟的豬IFN-γ與牛，犬，馬，貓等分別有72%~79%的同源性，與棉鼠，人，小鼠，大鼠及恒河猴等有41%~57%的同源性。

IFN-γ由T淋巴細胞和NK細胞產(chǎn)生，用以抗病毒和干擾增殖，此外，IFN-γ還有與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的幾種功能包括調(diào)節(jié)細胞的增殖和程序性死亡，刺激或抑制不同基因的表達。IFN-γ能通過誘導產(chǎn)生吲哚胺2，3-雙加氧酶來抗弓形蟲和衣原體的感染。IFN-γ是效應強烈的單核吞噬細胞增強劑，IFN-γ是通過增強單核吞噬細胞的Mac-1的表達來達到增強胞飲作用和吞噬作用的。IFN-γ通過增加巨噬細胞的氧自由基和TNF-α的釋放來達到增強殺腫瘤細胞的作用。IFN-γ選擇性地提高包括因LPS刺激的B細胞的IgG2a和因2型T細胞呈遞抗原而引起的B細胞的IgG3的釋放量。有報道稱IFN-γ能引起細胞的自分泌IFN-γ作用的增強。

檢測原理:

本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法檢測樣本中IFN-γ的濃度。IFN-γ捕獲抗體已預包被于酶標板上，當加入標本或參考品時，其中的IFN-γ會與捕獲抗體結(jié)合，其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。當加入生物素化的抗豬IFN-γ抗體后，抗豬IFN-γ抗體與IFN-γ接合，形成夾心的免疫復合物，其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。隨后加入辣根過氧化物酶標記的親合素。生物素與親合素特異性結(jié)合，親合素連接的酶就會與夾心的免疫復合物連接起來；其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。最后加入顯色劑，若樣本中存在IFN-γ將會形成免疫復合物，辣根過氧化物酶會催化無色的顯色劑氧化成藍色物質(zhì)，在加入終止液后呈黃色。通過酶標儀檢測，讀其450nm處的OD值，IFN-γ濃度與OD450值之間呈正比，通過參考品繪制標準曲線，對照未知樣本中OD值，即可算出標本中IFN-γ濃度。

豬IFN-γ定量分析酶聯(lián)免疫檢測試劑盒組成:

標本收集:

1.標本的收集請按下列流程進行操作；

A.細胞上清標本離心去除懸浮物后即可；

B.血清標本應是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；

C.血漿標本，推薦用EDTA的方法收集；

D.若待測樣本不能及時檢測，標本收集后請分裝，凍存于－20℃，避免反復凍融。

2.血清標本不應添加任何防腐劑或抗凝劑；

3.標本應清澈透明，檢測前樣本中如有懸浮物應通過離心去除。

4.請勿使用溶血，高血脂或污染的標本檢測，否則結(jié)果將不準確。

注：豬血清或血漿樣本請用樣本分析緩沖液做倍比稀釋后再檢測。

注意事項:

1.試劑盒請保存在2～8℃。

2.濃縮洗滌液因在低溫下可能有結(jié)晶，請水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制工作液。

3.標準品復溶加樣后，剩余部份請丟棄。

4.底物請勿接觸氧化劑和金屬。

5.加樣時，請及時更換槍頭，避免交叉污染。

6.嚴禁混用不同批號的試劑盒組份。

7.充分混勻?qū)ΡＷC反應結(jié)果的準確性很重要，在加液后請輕輕叩擊邊緣以保證混勻。

8.室溫反應，請嚴格控制在25-28℃。

9.洗滌過程是至關(guān)重要的，洗滌不充分會使精確度下降并導致結(jié)果誤差較大。

10.試驗中標準品和樣本檢測時建議作雙復孔。

11.加樣過程中避免氣泡的產(chǎn)生。

12.血清和血漿標本的檢測時，檢測抗體的孵育時間應適當延長

檢測前準備工作:

1.試劑盒自冰箱中取出后應置室溫（25-28℃）平衡20分鐘；每次檢測后剩余試劑請及時于2～8℃保存。

2.將濃縮洗滌液用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加19份水)。

3.如有5x標準品稀釋液，請按所需量用雙蒸水或去離子水稀釋。

4.標準品: 按標簽復溶體積加入1X去離子水復溶使IFN-γ終濃度達到4000pg/ml，室溫反應，請嚴格控制在25～28℃，靜置15~20分鐘后輕輕混勻（建議抽吸幾次）待徹底溶解，用標準品稀釋液倍比梯度稀釋后依次加入檢測孔中。（標準曲線取七個點，最高濃度為4000 pg/ml,標準品稀釋液直接加入作為0濃度.）

洗滌方法:

自動洗板機或人工洗板：每孔洗滌液為300ul，注入與吸出間隔15-30秒。最后一次洗板完成后將板倒扣著在厚吸水紙上用力拍干。

實驗過程需自備的材料：

1.不同規(guī)格的加樣槍及相應的槍頭；   

2.酶標儀；

3.自動洗板機；                    

4.去離子水或雙蒸水；

操作步驟:

1.通過計算并確定一次性實驗所需的板條數(shù)，取出所需板條放置在框架內(nèi)，暫時用不到板條請放回鋁箔袋密封，保存于4℃。

2.建議設置本底較正孔，即空白孔,設置方法為該孔只加TMB顯色液和中止液。每次實驗均需做標準品對照并畫出標準曲線。

3. 分別將樣品或不同濃度標準品按照100μl/孔加入相應孔中，用封板膜封住反應孔，室溫（25-28℃）孵育120分鐘。對于血清血漿樣本，先加50ul的樣本分析緩沖液，再加50uL樣本。如檢測超出范圍，請先加50ul的樣本分析緩沖液，再加入用標準品稀釋液稀釋后的樣本50μl檢測。請注意記錄好樣品的稀釋倍數(shù)，此處加樣量50ul相當于已稀釋了2倍。      

4.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

5.加入生物素化抗體工作液(100ul/孔)。用封板膠紙封住反應孔，室溫（25-28℃）孵育60分鐘。   

6.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

7.加入親和素連接的HRP酶工作液(100ul/孔)。用封板膠紙封住反應孔，避光室溫（25-28℃）孵育20分鐘。   

8.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

9.加入顯色劑TMB100ul/孔，避光室溫（25-28℃）孵育20分鐘。

10.加入終止液50ul/孔,混勻后即刻測量OD450值。

結(jié)果判斷:

1.復孔的值在20%的差異范圍內(nèi)結(jié)果才有效，復孔的值平均后可作為測量值。

2.每個標準品或標本的OD值應減去本底校正孔的OD值。

3.手工繪制標準曲線。以標準品濃度作橫坐標，OD值作縱坐標，以平滑線連接各標準品的坐標點。通過標本的OD值可在標準曲線上查出其濃度。

4.若標本OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測，計算濃度時應乘以稀釋倍數(shù)。

典型數(shù)值和參考曲線